Metabolismo e Fisiologia

Coordinatore: Prof. Maurizio Servili – UNIPG-PERUGIA, Prof. Riccardo Gucci – UNIPI-PISA

Obiettivi

Gli obiettivi prioritari della ricerca sono i seguenti:

  • Evidenziare la variabilità in alcune importanti cultivar e negli olivi selvatici dei metaboliti del frutto, con particolare attenzione ai composti di interesse salutistico;
  • Analizzare le relazioni tra enzimi endogeni e composizione in composti fenolici del frutto e dell’olio vergine di oliva;
  • Analizzare le relazioni tra enzimi endogeni del frutto e produzione di composti volatili ad impatto sensoriale nell’olio extravergine di oliva.

Attività previste

Si ritiene che l’analisi genomica del frutto non possa prescindere dalla conoscenza dettagliata dei profili metabolici corrispondenti alle diverse fasi di sviluppo e maturazione della drupa.
Sono previste pertanto le seguenti attività, da considerare propedeutiche a quelle del Modulo 5B (Crescita, sviluppo e maturazione del frutto):

8.1. Studio della variabilità dei metaboliti del frutto in alcune importanti cultivar di interesse nazionale e negli olivi selvatici con particolare attenzione ai composti di interesse salutistico (UNIPG, CRA-OLI)
Al fine di studiare le relazioni tra la composizione in composti fenolici e l’espressione dei geni che regolano la composizione di questi composti nel frutto verrà condotta l’analisi della frazione fenolica su alcune cultivar caratterizzate da diversi comportamenti fisiologici legati alla sintesi ed al metabolismo di questi composti nel corso della maturazione del frutto. Verranno scelte cultivar caratterizzate da alti e bassi livelli di concentrazione fenolica nelle drupe. Le piante da cui prelevare il materiale verranno sottoposte a regime idrico controllato. L’evoluzione della frazione fenolica verrà studiata nel corso della maturazione a partire dalla fase di allegagione. Lo studio dell’evoluzione della frazione fenolica verrà condotto anche considerando l’apporto differenziato delle diverse parti del frutto alla sua composizione fenolica complessiva, nello specifico l’epicarpo, il mesocarpo e l’endocarpo. Saranno analizzati i composti precursori dei composti fenolici dell’olio extravergine di oliva ed in particolare: secoiridoidi quali l’oleuropeina, la demetiloleuropeina, il nuzenide ed il ligustroside, lignani quali l’acetossipinoresinolo ed il pinoresinolo, cinnamil derivati come il verbascoside ed alcuni flavonoidi come la rutina e la luteolina 7-glucoside. L’analisi quantitativa dei composti fenolici verrà effettuata a partire dall’estratto metanolico proveniente dai tessuti della drupa, per HPLC utilizzando diversi detector quali diode array e detector fluorimetrico. Le caratteristiche strutturali dei componenti fenolici così come quelle di alcuni metaboliti, intermedi di reazione relativi alla sintesi od al metabolismo, della sostanze fenoliche che potranno essere evidenziati nel frutto nel corso della maturazione verrà effettuata mediante HPLC-UV, LC-MS/MS e SRM-MS/MS.

8.2. Analisi delle relazioni tra enzimi endogeni e composizione in composti fenolici nel frutto e nell’ olio vergine di oliva (UNIPG, UNITUS)
La concentrazione dei composti fenolici nel corso della maturazione del frutto verrà messa in relazione all’evoluzione di alcune attività enzimatiche endogene che sono implicate nella sintesi o nel metabolismo della frazione fenolica con particolare riferimento ai secoiridoidi che rappresentano i composti più concentrati ed esclusivi del frutto e dei relativi oli extravergine di oliva.
In questo contesto, oltre ad alcuni enzimi chiave da individuare nella sintesi dell’acido elenolico che è parte della struttura chimica dei secoiridoidi, verrà analizzata l’evoluzione di alcuni enzimi quali la β-glucosidasi e la metilesterasi, che regolano la trasformazione dei secoiridoidi glucosidi, quali l’oleuropeina, la demetiloleuropeina e ligustroside nei corrispondenti agliconi. Questi ultimi composti vengono rilasciati nell’olio nel corso del processo di estrazione meccanica e rappresentano i composti fenolici di maggiore importanza quantitativa e qualitativa degli oli extravergine di oliva.
Un secondo gruppo di enzimi dei quali verrà studiata la relazione con la frazione fenolica del frutto è rappresentato dalle ossido reduttasi, quali la polifenolossidasi e la perossidasi, responsabili della degradazione ossidativa di tali composti nel corso del processo di estrazione meccanica. L’attività dei suddetti enzimi verrà valutata nel frutto durante la sua maturazione. Inoltre l’attività delle polifenolossidasi e perossidasi verrà analizzata nel corso del processo di estrazione meccanica al fine di individuare le relazione tra attività enzimatiche e concentrazione finale dei composti fenolici nell’olio extravergine di oliva.

8.3. Analisi delle relazioni tra enzimi endogeni del frutto e produzione di composti volatili ad impatto sensoriale dell’olio extravergine di oliva (UNIPG, UNITUS)
Per quanto riguarda le sostanze volatili ad impatto sensoriale, l’attenzione verrà focalizzata sulla via delle lipossigenasi, che rappresenta la pathway più importante legata alla sintesi dei componenti volatili degli oli extravergini di oliva. In questo contesto su alcune cultivar caratterizzate da un diverso profilo aromatico degli oli verrà studiata la produzione di aromi nel corso della maturazione del frutto. Verrà valutato anche l’apporto delle attività enzimatiche presenti nelle parti costitutive del frutto quali l’epicarpo, il mesocarpo e l’endocarpo nella produzione di aromi degli oli extravergini di oliva. Queste valutazioni verranno effettuate sul tessuto vegetale del frutto triturato ed analizzato via GS-MS. I suddetti rilievi analitici verranno effettuati anche sulle paste di oliva e sui relativi oli nel corso del processo di estrazione meccanica al fine di evidenziare le relazioni tra la produzione aromatica degli enzimi contenuti nelle paste ed il relativo trasferimento nell’olio. La produzione aromatica verrà poi associata allo studio dell’evoluzione, nel corso della maturazione ed in fase di estrazione meccanica, di alcuni enzimi chiave della pathway della lipossigenasi, quali la lipossigenasi propriamente detta, l’idroperossido liasi e l’alcol-acetil transferasi.

8.4. Analisi dei profili di espressione proteica differenziale (UNIPG, CRA-OLI)
Dall’analisi di espressione genica saranno selezionati i genotipi con le maggiori alterazioni. Su questi ultimi verrà eseguita un’analisi del proteoma con la metodica LC-Chip/MS (Agilent Technologies) da campioni di drupa nei tre stadi di sviluppo prescelti e da piante allevate in condizioni ambientali differenziate.
Saranno quindi individuati e isolati gruppi di trascritti e di proteine alterati in risposta allo sviluppo della drupa, alle condizioni ambientali e alle caratteristiche del genotipo. L’integrazione di questi dati con le specifiche caratteristiche agronomiche dei campioni in esame sarà utile ad individuare un set di almeno 10 marcatori correlati a caratteri qualitativi e di tipicità. I geni candidati saranno infine sequenziati nei genotipi selvatici e coltivati per identificare alleli di potenziale interesse agronomico.
Si propone, inoltre, di avviare uno studio di metabolomica e proteomica dell’olivo, rispettivamente, della natura e biosintesi dei fenoli della pathway dell’oleuropeina e del polimorfismo enzimatico delle -glucosidasi, attraverso l’applicazione della spettrometria di massa e della spettrometria di massa tandem, utilizzando l’API 4000 QTRAP Proteomica  e il “Fingerprint” metabolico ottenuto dalla combinazione di spettri FT-IR, FT-NIR/NIRA o Py-MS e analisi chemometrica dei dati, al fine di studiare i cambiamenti metabolici che intervengono in risposta a particolari situazioni di stress (Gidman et al., 2003).

8.5. Valutazione degli effetti dell’ambiente di coltivazione e di differenti regimi idrici sul contenuto in metaboliti secondari delle olive e dell’olio di oliva (UNIPI)
Verranno condotte analisi del contenuto in polifenoli e aromi (con particolare riferimento ai terpenoidi) in foglie, fiori e frutti a differenti stadi sviluppo e verrà valutata l’espressione di geni potenzialmente coinvolti nelle relative vie biosintetiche, in funzione di differenti livelli di stress idrico, di diversi ambienti di coltivazione e dell’annata di produzione. Verranno esaminati genotipi caratterizzati da diversi livelli di biosintesi in polifenoli e aromi, tra quelli scelti nell’ambito del WP5 del presente progetto. Nello specifico, nella ricerca proposta verranno considerate almeno due differenti cultivar, caratterizzate da alto e basso contenuto in polifenoli e aromi, coltivate in due differenti ambienti e sottoposte a tre diversi livelli di regime idrico, così come riportato da Gucci et al. (2007). La base dei campioni deriverà da prove in campo in deficit idrico controllato derivanti da una consolidata attività dell’UNIPI. Una parte dei campioni verrà immediatamente utilizzata per le analisi dei polifenoli e degli aromi (UNIPG; UNIPI-DCDSL), mentre una parte verrà conservata per l’estrazione dell’RNA e l’analisi dell’espressione genica che verrà effettuata nell’ambito del Modulo 5B.
Per investigare se esiste un nesso tra i meccanismi di sintesi e accumulo dei triacilgliceroli nella drupa e la resa in olio, si studierà in maniera comparativa la dinamica della formazione dei corpi oleosi tra varietà contrastanti per tale caratteristica. In particolare, attraverso la metodologia del CRY-SEM verrà studiata a livello ultrastrutturale la sintesi, l’accumulo e la compartimentazione dei corpi oleosi nella drupa di varietà a basso ed alto contenuto in olio. Si indagherà infine se alcune peculiarità di compartimentazione già note per alcune cultivar possano essere messe in relazione alla qualità degli oli estratti (CNR-IGV-PG).

8.6. Identificazione delle varietà di maggior pregio ai fini dell’ottimizzazione della qualità organolettica e salutistica degli oli regionali

Le varietà locali ritenute più interessanti per comportamento in campo e adattamento all’ambiente verranno caratterizzate dal punto di vista metabolico, per definire il profilo di composti aromatici, organolettici e salutistici che le distinguono.
Frutti di questi genotipi verranno analizzati per i composti precursori dei composti fenolici dell’olio ed in particolare secoiridoidi, lignani e cinnamil-derivati e verrà studiata l’evoluzione di alcuni enzimi chiave per la sintesi dei secoridoidi e dei composti aromatici caratteristici degli oli extra vergini.
I rilievi analitici verranno effettuati anche sui relativi oli al fine di evidenziare le relazioni tra la produzione aromatica degli enzimi contenuti nei frutti ed il loro trasferimento nell’olio.
Lo studio consentirà di definire, regione per regione, il set di varietà di interesse strategico per il rilancio di produzioni locali di eccellenza.

I dati generati saranno opportunamente assemblati ed organizzati in una banca dati nell’ambito del Modulo 4 – Piattaforma bioinformatica.