Organi riproduttivi (fiore, frutto)

In considerazione dell’importanza degli organi riproduttivi, la cui formazione condiziona la produzione quantitativa e qualitativa della pianta e tenendo conto degli enormi gap conoscitivi inerenti alla loro differenziazione e sviluppo, si ritiene opportuno raggruppare le attività in due parti, interattive tra loro, al fine di concentrare e coordinare efficacemente le sperimentazioni biologiche e le attività di ricerca, quelle relative al fiore (5A) e quelle del frutto (5B).

5A- Induzione del fiore e sviluppo degli organi riproduttivi

Coordinatori: Prof. Gianni Barcaccia – UNIPD, PADOVA
                        Prof. Rosario Muleo – UNITUS, VITERBO

Obiettivi

Individuare e comprendere i processi biologici e fisiologici che controllano il cambiamento di fase nella specie, la regolazione annuale dell’induzione fiorale, lo sviluppo degli organi riproduttivi, i meccanismi di auto-sterilità e lo sviluppo di fiori staminiferi con/senza aborto del gineceo. Particolare attenzione sarà posta nelle fasi di sviluppo dei gameti e nel primo stadio di allegagione del frutto. Questi aspetti, infatti, rivestono particolare importanza per la forte disomogeneità riscontrabile tra i diversi genotipi e per le conseguenze sulla produzione dei frutti.

Attività

Le due Unità di Ricerca opereranno in stretta e coordinata collaborazione e si interfacceranno con altre Unità di Ricerca nell’ambito dello studio di target biologici specifici.

5A. 1. Studio del cambiamento di fase (UNIPD, UNITUS)
Sarà studiato il cambiamento di fase (passaggio dallo stadio giovanile a quello riproduttivo) in piante da seme (ottenute dalle progenie usate per la mappatura genetica) e da piante propagate per talea derivanti da parti giovanili (non in grado di fruttificare) e mature dell’albero, per tre anni consecutivi e a condizioni ambientali induttive. Su piante dello stesso genotipo saranno condotti studi sui racemi fiorali in momenti caratteristici e specifici dello sviluppo del fiore, compresi tra le fasi pre-meiotiche a quelle di post-allegagione dei frutti, per individuare la regolazione dell’induzione, dello sviluppo del fiore e del frutto. Saranno oggetto di studio:
a. generazione del segnale di regolazione del cambiamento di fase, ruolo induttivo dell’organo foglia e ruolo di competenza dell’organo gemma;
b. generazione del segnale di induzione fiorale nella foglia e influenza dei fattori ambientali e nutrizionali sulla competenza annuale;
c. ruolo del “core regolativo” del complesso Fotorecettori-Constants-Flowering time (in considerazione della stretta connessione di questo sistema con la regolazione della vernalizzazione nella pianta arborea);
d. individuazione dei complessi endogeni di regolazione dello sviluppo degli organi fiorali,
e. meiosi e formazione dei gameti;
f. determinazione dei sistemi di auto-sterilità (auto-incompatibilità, sfasamento temporale, ecc.) e identificazione di fattori per la maschiosterilità e analisi della diversità genica e genotipica;
g. regolazione dello sviluppo di fiori staminiferi ed aborto del pistillo e del gineceo, ruolo dei fattori nutrizionali nella regolazione;
h. hub regolativi della cascola fiorale nel racemo;
i. regolazione dell’allegagione del frutto, primi stadi dello sviluppo e fattori ambientali di regolazione, diversità genotipica.

5A.2. Analisi del trascrittoma del fiore (UNITUS)
Un’ampia ed accurata analisi del trascrittoma interesserà le gemme a fiore e gli organi riproduttivi di fiori a diversi stadi di sviluppo, precedentemente caratterizzati a livello citologico. La caratterizzazione estesa dei profili di espressione genica sarà sviluppata con le piattaforme microarray CombiMatrix, nell’ambito del Modulo 2- Genomica funzionale. Le stesse piattaforme saranno riutilizzate per più esperimenti di espressione genica al fine di condurre studi comparativi.
Le variazioni di risposta trascrizionale saranno ulteriormente studiate per evidenziare, oltre alle risposte qualitative anche risposte quantitative legate al livello di accumulo dei trascritti e di specifici regolatori di crescita e di metaboliti, con la conseguente possibilità di delineare un quadro dettagliato dei diversi livelli di regolazione del cambiamento di fase, dello sviluppo del fiore, dei fenomeni di apoptosi e dell’allegagione, in risposta ai sistemi intrinseci di sviluppo della pianta (orologio biologico e fattori endogeni, come ad esempio il livello di metilazione) e ai fattori ambientali e nutritivi. Particolare attenzione sarà rivolta all’allestimento di vasti repertori di EST specifici di antere e pistilli, al fine di identificare e caratterizzare geni coinvolti nella regolazione dello sviluppo del fiore, degli organi riproduttivi, nella formazione di spore e gameti, così come geni candidati al controllo di barriere riproduttive specifiche, come l’auto-incompatabilità gametofitica e la maschiosterilità citoplasmatica.
Saranno, inoltre, analizzati i profili di espressione del proteoma per evidenziare diversità di accumulo e modifiche post-traduzionali dell’insieme del proteoma o di singole proteine (in collaborazione con ENEA e CRA-GPG).

5A.3. Analisi della regolazione epigenetica. (UNITUS)
Un primo studio sul livello di regolazione epigenetica, condotto con il sistema methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP), permetterà di chiarire ulteriormente il comportamento e l’interazione del complesso sistema di regolazione del cambiamento di fase dei/con i fattori endogeni della pianta che agiscono nell’induzione fiorale e nel processo di apoptosi, così come in altri target biologici. Per gli aspetti di regolazione epigenetica si prospetta lo sviluppo di sistemi di methylation-array da produrre in collaborazione con ENEA.
Individuare le interazioni dei pathways che regolano le risposte della pianta aiuterà a comprendere i complessi di coordinamento (hub) delle risposte adattive a livello di cellula e di organi della pianta stessa. Ad esempio occorre considerare che un “hub di regolazione” controlla sia il cambiamento di fase sia l’induzione fiorale così come l’adattamento al riposo invernale (inwintering) e al freddo. La ricerca su questo particolare hub di coordinamento della risposta adattativa in olivo sarà condotta in collaborazione tra UNIVT-DiProv, CNR-IVGPG e l’University of Warwick (HRI, Wellesbourne, UK).

5A.4. Validazione dei modelli di espressione (CNR-IGVPG e CRA-GPG)
I modelli di espressione verranno validati mediante metodologie high throughput di PCR Real-Time con geni identificati e annotati. Si procederà inoltre all’analisi della regolazione genica interattiva dei microRNA e dei relativi target, con costruzione di microarray specifici dedicati ai target biologici. Gli studi dell’espressione allelica contribuiranno a chiarire la diversità della regolazione dei trascritti tra organi diversi in genotipi differenti e a diverse condizioni induttive dello sviluppo ed ambientali. Per l’insieme dei target biologici oggetto di studio saranno individuati reference ottimali, da utilizzare durante le procedure di normalizzazione dei risultati.
I risultati conseguiti potranno avere importanti ricadute ed essere utilizzati in lavori di caratterizzazione genetico-molecolare e funzionale di cultivar di olivo contrastanti per il grado di induzione fiorale, auto-sterilità e per il livello di fertilità del polline o vitalità delle ovocellule, cascola e allegagione.
I dati generati saranno opportunamente assemblati ed organizzati in una banca dati nell’ambito del Modulo 4 – Piattaforma bioinformatica.

5B– Crescita, sviluppo e maturazione del frutto

Coordinatori: Prof. Pietro Tonutti – SSSA, PISA
Prof. Enrico Pè – SSSA, Pisa

Obiettivi

Obiettivo primario del Modulo è l’analisi genetica dello sviluppo e maturazione del frutto, e dei processi metabolici relativi ai composti primari e secondari veicolati nell’olio. Ci si propone di studiare i processi di allegagione e le dinamiche di cascola dei frutticini post-allegagione, le basi fisiologiche e molecolari della cascola fisiologica dei frutticini, i processi di crescita e sviluppo del frutto e la sindrome della maturazione.

Attività

5B.1. Analisi genetica dell’allegagione e della cascola (SSSA) 
Verranno selezionati genotipi con caratteristiche diverse in relazione all’allegagione e cascola fisiologica post-allegagione con l’obiettivo di individuare fattori coinvolti nel processo di separazione cellulare e di distacco dell’organo neo-formato.
Verranno allestite librerie cDNA ed effettuate analisi comparate dei profili di trascrizione dei frutticini o parti di essi caratterizzati da diversa predisposizione alla cascola post-allegagione. Questa attività sarà sviluppata con le piattaforme microarray CombiMatrix messe a punto nel Modulo 2 – Genomica funzionale. Verranno effettuate correlazioni molecolari e fisiologiche relativamente al livello di specifici regolatori di crescita presenti durante le fasi immediatamente successive all’allegagione e i profili di trascrizione al fine di descrivere un quadro dettagliato e identificare i fattori responsabili del destino dei frutticini.
In una fase più avanzata – lignificazione dell’endocarpo – verranno posti a confronto genotipi con diversa predisposizione naturale alla cascola in relazione a stati di stress idrico. Le conoscenze fisiologiche e molecolari già disponibili per altre specie arboree (es. melo e pesco) nelle quali il processo di abscissione è stato ampiamente studiato, saranno di grande utilità per meglio delucidare i meccanismi dei processi che portano al distacco del frutticino. In particolare ed in sinergia col modulo 7A (per lo studio degli effetti di stress abiotici sull’entità della cascola), saranno allestite analisi su larga scala per l’identificazione di geni coinvolti nell’attivazione delle zone di abscissione al fine di caratterizzare (ed eventualmente controllare) il processo. A tal fine sarà estremamente utile l’utilizzo del laser capture microdissection (LCM), per isolare singole cellule da preparati di zone di abscissione, con l’ausilio di un microscopio dotato di laser.

5B. 2. Analisi genetica della maturazione (SSSA)
Per quanto riguarda il frutto, saranno allestite librerie cDNA da mesocarpo ed epicarpo prelevati in corrispondenza di diversi stadi di sviluppo selezionando quelli che producono frutti caratterizzati da diversi tratti morfologici e biochimici. Verranno comparate cultivar a diverso pattern di crescita, sviluppo e maturazione con processi metabolici marcatamente diversi (alto e basso contenuto in olio, diverso pattern di accumulo dei polifenoli, tocoferoli, terpeni,  alto e basso peso del frutto, diverso rapporto polpa/nocciolo, maturazione rapida/contemporanea o lenta/scalare, ecc.).  Librerie EST da frutto di diverse varietà e a diversi stadi di sviluppo (primo stadio di crescita esponenziale, lignificazione dell’endocarpo, seconda fase di crescita esponenziale, invaiatura, piena pigmentazione) verranno allestite ed utilizzate per identificare geni differenzialmente espressi nelle diverse fasi e/o fra diversi genotipi.

5B.3. Validazione dei modelli di espressione (SSSA, CNR-IGVPG)
In un primo tempo si utilizzeranno i dati di sequenziamento 454 per determinare variazioni “eclatanti” della rappresentatività dei singoli trascritti fra diversi genotipi e nel corso dello sviluppo della drupa. Per analisi più estese si procederà a monitorare il trascrittoma, utilizzando la piattaforma Combimatrix e successive validazioni via qRT-PCR. Verranno identificati ed annotati i geni coinvolti nel metabolismo dei lipidi, dei fenoli e dei composti volatili tramite analisi comparativa con altre specie vegetali utilizzando piattaforme e software disponibili (es. KEGG, MapMan) . Per il metabolismo lipidico sverranno inoltre ricercati i geni con segnali per la localizzazione nel cloroplasto o nel reticolo endoplasmatico, che sono i principali comparti cellulari deputati alla sintesi degli acidi grassi, utilizzando software e web services di predizione. L’annotazione dei vari modelli genici identificati verrà validata manualmente attraverso allineamento di EST già disponibili o che saranno rese disponibili nel corso del progetto.
Particolare enfasi verrà posta sullo studio dei fattori di trascrizione legati a metabolismi ormonali in relazione al processo di maturazione: ciò potrà consentire di approfondire le conoscenze sui meccanismi di base – e sul ruolo che su di essi esercitano gli ormoni- che regolano il procedere della maturazione il cui controllo o modulazione è strategico in un’ottica di produzioni di qualità.

5B. 4. Approcci di systems biology (CRA-OLI)
In collaborazione con altre UR, si procederà, su campioni preliminarmente selezionati, ad approcci di Systems Biology coniugando analisi di trascrittomica a quelle di proteomica e metabolomica. Saranno effettuati studi di proteomica sulla natura e biosintesi dei fenoli, sul pathway di sintesi dell’oleuropeina e sul polimorfismo di enzimi chiave (β-glucosidasi, lipossigenasi, ecc.) attraverso l’applicazione della spettrometria di massa e della spettrometria di massa tandem, utilizzando l’API 4000 QTRAP. L’integrazione fra questi aspetti sarà massima con quelli del Modulo 5A inerente l’allegagione del frutto e con il Modulo 7 per una migliore comprensione dei rapporti fra produttività e stress e con il Modulo 8 per rapportare i dati genomici con quello biochimici/fisiologici.

I dati generati saranno opportunamente assemblati ed organizzati in una banca dati nell’ambito del Modulo 4 – Piattaforma bioinformatica.