Resistenza agli stress (abiotici e biotici)

Stress biotici

Coordinatori: Dr. Enzo Perri – CRA-OLI, RENDE (CS), Prof. Rosa Rao – UNINA, PORTICI

Le attività previste si propongono:

  • l’identificazione e caratterizzazione di geni coinvolti nella resistenza all’attacco dei patogeni Verticillium dahliaeSpilocaea oleagina e Pseudomonas savastanoi,
  • l’identificazione e caratterizzazione di geni coinvolti nei meccanismi di risposta della pianta all’attacco della mosca (Bactrocera oleae),
  • la caratterizzazione e localizzazione in situ del loro pattern di espressione,
  • la definizione dei profili metabolico e proteico correlati alla risposta della pianta agli stress biotici.

Attività previste

7A.1. Studio dell’interazione pianta/patogeno (CRA-OLI)
Si procederà con:

  • individuare e comprendere i processi biologici e molecolari che controllano le interazioni pianta-patogeno (Verticillium dahliae, Spilocaea oleagina e Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi);
  • identificare geni coinvolti nei meccanismi di difesa diretta ed indiretta responsabili delle risposte adattative di piante suscettibili e tolleranti agli attacchi di patogeni;
  • identificare geni i cui prodotti di codificazione sono contemporaneamente presenti nelle vie metaboliche indotte come risposta di difesa elicitate dagli agenti patogeni;
  • studiare la variabilità ed il controllo genetico della risposta della pianta ai principali agenti patogeni;
  • individuare i loci o le regioni cromosomiche che controllano la resistenza genetica qualitativa e/o quantitativa.

Le osservazioni e le analisi verranno condotte su varietà con comportamento opposto rispetto alla risposta all’attacco del patogeno e su popolazioni derivanti da incrocio intervarietale e segreganti per il carattere di resistenza. Varietà e semenzali verranno allevati in condizioni controllate e preliminarmente valutati attraverso test di suscettibilità in relazione ai diversi patogeni.
Campioni verranno raccolti da tessuti sani e attaccati a diversi stadi di infezione in relazione alla biologia di ogni singolo patogeno su cultivar resistenti e suscettibili. Verranno applicate diverse metodologie di analisi dell’espressione genica differenziale quali SSH, microarray e sequenziamento massivo dei diversi campioni e sottrazione in silico.
Il livello di espressione genica verrà analizzato in real time PCR.
Le attività svolte offriranno la possibilità di perseguire strategie biotecnologiche basate sull’arricchimento e/o diversa regolazione dei singoli alleli o di miRNA, la mutazione di geni MIR o geni target dei miRNA e/o il disegno di miRNA artificiali per regolare l’espressione dei geni implicati nel controllo dei target biologici oggetto di studio.
Sui geni putativamente coinvolti nella resistenza o nella trasmissione del segnale o nei pathway di metaboliti direttamente correlati alla resistenza verranno identificati SNP che potranno essere impiegati nelle analisi di association mapping previste nel Modulo 3 per identificare quegli SNP effettivamente associati al fenotipo resistente.
Poiché la risposta della pianta può essere fortemente condizionata dalla variabilità dei patogeni una parte delle attività verrà dedicata alla caratterizzazione molecolare dei principali patogeni, con particolare riferimento ai diversi patotipi di V. dahliae (Defoglianti e Non Defoglianti), ai diversi ceppi di S. oleagina e diPseudomonas savastanoi pv. savastanoi nei diversi areali olivicoli.

Tenuto conto dei pathway metabolici coinvolti nei meccanismi di risposta, verranno presi in considerazione i seguenti: i) la via di biosintesi dei tocoferoli (vitamina E), composti antiossidanti coinvolti nei meccanismi di difesa del frutto e ii) il metabolismo dei fenoli specifici dell’olivo, con particolare riferimento ai secoiridoidi. Sono già stati isolati e caratterizzati dal gruppo proponente alcuni geni coinvolti in queste pathway, tra i quali il gene GeranylGeranyl Reduttasi (CHLP) (Bruno et al. 2009) e Alcool Deidrogenasi (ADH) implicato nella formazione di alcooli lungo il pathway avviato dalla LOX.

7A.2. Identificazione dei geni e degli elementi regolativi coinvolti nel meccanismo di risposta dell’olivo all’attacco della mosca (UNINA, CRA-OLI, CNR-IGV)
Si intende:

  • Individuare e comprendere i processi biologici e molecolari che controllano le interazioni pianta-insetto (olivo-Bactrocera oleae);
  • identificare geni coinvolti nei meccanismi di difesa diretta ed indiretta responsabili delle risposte adattative di piante suscettibili e tolleranti agli attacchi;
  • identificare i geni i cui prodotti di codificazione sono contemporaneamente presenti nelle vie metaboliche indotte come risposta di difesa elicitate dall’insetto;
  • individuare i loci o le regioni cromosomiche per la resistenza genetica qualitativa e/o quantitativa alla mosca;

Sulla base di studi pregressi, che hanno consentito di individuare in alcuni casi le cause che conferiscono ai genotipi di olivo minore suscettibilità, come il coinvolgimento delle sostanze fenoliche quali oleuropeina e cianidina (Konno et al., 1999; Kubo et al., 1998), identificare e isolare alcune sequenze putativamente coinvolte nell’induzione di maggiore o minore suscettibilità a B. oleae.
Verrà caratterizzato un ampio repertorio di EST indotto dall’attacco di Bactrocera oleae nei diversi stadi di sviluppo della drupa in genotipi con differenziati livelli di suscettibilità alla mosca.
Allo scopo di identificare geni coinvolti nelle interazioni olivo/insetto adulto e olivo/larva, saranno allestite librerie sottrattive da frutti sani e attaccati dalla mosca a vari stadi di sviluppo della larva, su cultivar più o meno sensibili. Le osservazioni potranno essere effettuate nel campo collezione del germoplasma del CRA OLI, per consentire di studiare i genotipi nelle medesime condizioni agroambientali.
Frammenti differenzialmente espressi saranno caratterizzati mediante analisi bioinformatica ed i relativi profili di espressione verranno validati mediante PCR Real Time.
Per l’identificazione degli omologhi in olivo di geni direttamente implicati nella resistenza agli insetti e ai patogeni precedentemente identificati in altre specie si procederà con l’amplificazione tramite primer degenerati e tecnologia 5’ e 3’ RACE di sequenza complete dei cDNA dei geni d’interesse.
Tenuto conto dei pathway metabolici coinvolti nei meccanismi di risposta all’insetto, verranno presi in considerazione i seguenti: i) il metabolismo dei fenoli specifici dell’olivo, con particolare riferimento ai secoiridoidi e ii) il pathway metabolico della Lipossigenasi (LOX), da cui si originano composti volatili responsabili dell’aroma e quindi anche dell’attrattibità nei confronti dell’insetto.

7A.3. Analisi cito-istologica delle alterazioni morfologico-strutturali conseguenti agli attacchi di patogeni e parassiti.(UNICAL) 
Allo studio del pattern di espressione genica negli organi oggetto di studio sarà associata l’analisi a livello cito-istologico delle alterazioni morfologico-strutturali e delle condizioni cito-fisiologiche, da correlare al timing d’espressione in situ.
Per la localizzazione dell’espressione verrano svolti esperimenti di ibridazione in situ, e/o qRT-PCR a partire da RNA estratto da singole cellule mediante tecniche di microdissezione laser, ove necessario in relazione alla specificità tissutale.
Quest’ultimo approccio potrà rivelarsi particolarmente utile per valutare il pattern di espressione nei distretti di tessuto specificatamente interessati dall’attacco del’insetto.
I livelli di espressione verranno monitorati in relazione allo stadio di infezione e agli organi bersaglio.

7A.4. Correlazione del profilo di espressione dei geni con la produzione dei metaboliti d’interesse e identificazione di marcatori proteici per la diagnostica molecolare di patologie e resistenze (CRA-OLI, UNICAL, UNITUS)
Si procederà anche a valutare il contenuto di metaboliti direttamente correlabili ad un particolare comportamento (alta e bassa suscettibilità) delle cultivar per chiarire i principali meccanismi di difesa che la pianta mette in atto. Questo studio biochimico-metabolomico verrà messo in relazione all’analisi dell’espressione genica differenziale condotta in Real Time per i geni specificamente coinvolti nella produzione di tali metaboliti.
L’analisi dell’espressione genica sarà associata allo studio delle variazioni del profilo proteico e metabolico che si manifestano nella drupa infestata e punta dalla mosca. In particolare, estratti proteici preparati da frutti, raccolti dalle prove di allevamento di genotipi tolleranti o suscettibili in condizioni di attacco e non, verranno comparati su base quantitativa attraverso tecniche di elettroforesi bidimensionale. L’analisi quantitativa sarà realizzata mediante scansione densitometrica dei gel con software dedicati (Melanie, ImageMaster 2D Platinum). Le proteine differenzialmente espresse saranno identificate mediante approcci complementari di spettrometria di massa biomolecolare. A tal fine, si utilizzeranno tecniche di MALDI-TOF peptide mass fingerprinting e/o di nanoLC-ESI-LIT-MSn. I dati ottenuti saranno sottoposti ad analisi bioinformatica mediante software dedicati (Mascot, Sequest, ProteomeDiscoverer) (Rocco et al 2008). Le specie proteiche così identificate saranno integrate in una serie di network relazionali di tipo molecolare (UNIBN e ISPAAM-CNR).
Le modifiche metabolomiche saranno individuate mediante raccolta dei composti volatili (VOC) in “air entrainment” da drupe infestate e punte e successiva analisi gas cromatografica accoppiata alla spettrometria di massa (UNINA e ISPAAM-CNR). Il ruolo biologico di proteine e VOC differenzialmente espressi nei meccanismi di difesa dell’olivo sarà validato mediante biosaggi con la mosca e i suoi antagonisti naturali (UNINA) (Corrado et al., 2007).
I dati ottenuti verranno messi in relazione rispettivamente al contenuto in tocoferoli ed al profilo aromatico saggiato rispettivamente mediante HPLC-massa e gascromatografia-massa.
Il lavoro sarà articolato nelle seguenti fasi: identificazione e quantificazione, mediante tecnologia Q-TRAP LC/MS/MS su piattaforma API 3200 Q-TRAP, di proteine specifiche prodotte da Verticillium nei diversi stadi dell’infezione per approfondire le conoscenze dell’interazione, per individuare terapie idonee al contrasto dell’infezione ed eradicazione del patogeno e validazione dell’impiego di questi biomarcatori a scopo diagnostico. Analoga attività sarà condotta sulle piante al fine di identificare proteine correlate alla risposta della pianta a Verticillium.

Infine, i dati generati saranno opportunamente assemblati, annotati ed organizzati in una banca dati nell’ambito del Modulo 4 – Piattaforma Bioinformatica.

Stress abiotici

Coordinatore: Dr. Luigi Cattivelli – CRA-GPG, FIORENZUOLA D’ARDA

Obiettivi

Verranno studiate le risposte adattative dell’olivo a stress ambientali con particolare riferimento allo stress idrico, allo stress da sale (in collaborazione con DiProV-Unitus) ed allo stress da freddo, al fine di definire le basi molecolari dei processi di adattamento a stress e della vernalizzazione della pianta (in collaborazione con i Moduli 5 e 6 – Organi della Riproduzione ed Architettura dell’albero).

Attività

La problematica della resistenza a stress abiotici in olivo si caratterizza per alcuni aspetti peculiari, che riflettono la specifica nicchia ecologica in cui la specie si è evoluta ed adattata. L’olivo rappresenta la specie agraria che più di altre riflette un adattamento specifico all’ambiente mediterraneo, definito da inverni miti ed estati calde e siccitose: una specie tipicamente termofila ed eliofila con spiccati caratteri di xenofilia, suscettibile alle gelate invernali e straordinariamente tollerante alla siccità. Tuttavia, l’elevata variabilità genetica della specie ha consentito all’olivo di adattarsi ad alcune nicchie relativamente meno fredde dell’Italia settentrionale.
Nei confronti dello stress idrico l’olivo ha sviluppato specifici meccanismi fisiologici. Le piante sottoposte a siccità possono acquisire specifici adattamenti morfologici (Bosabalidis and Kofidis 2002), ridurre gli scambi gassosi limitando la traspirazione (Moriana et al., 2002) ed al contempo innalzare il gradiente di potenziale idrico tra foglie e radici (Xiloyannis et al., 1999). La risposta allo stress idrico in olivo si caratterizza per una forte capacità di aggiustamento osmotico (Dichio et al., 2005) e per un incremento dell’attività dei sistemi antiossidanti coinvolti nello “scavenging” dei radicali liberi dell’ossigeno (Sofo et al. 2004).
L’olivo rappresenta un perfetto sistema modello per la comprensione della resistenza a siccità, tuttavia la mancanza dei moderni strumenti di analisi genomica ha limitato sinora la possibilità di comprendere questi meccanismi e di trasferire le relative conoscenze in altre specie. Il sequenziamento del genoma dell’olivo e lo sviluppo di strumenti genomici offrono l’opportunità di investigare le basi molecolari della risposta a stress abiotico dell’olivo, identificando i geni e le basi molecolari responsabili dei processi di adattamento.
Questo Modulo si propone di sviluppare le conoscenze sulle basi molecolari della risposta dell’olivo a stress salino, idrico e da freddo e di interpretare i dati alla luce delle conoscenze già sviluppate in altre specie. Molti meccanismi di risposta a stress abiotici ed i geni che li determinano sono stati identificati in altre specie (dall’arabidopsis ai cereali, Yamaguchi Shinozaki et al 2006, Cattivelli et al., 2008, Mazzucotelli et al,. 2008). L’analisi della risposta dell’olivo allo stress da freddo ed allo stress idrico in confronto con le conoscenze fisiologiche già disponibili per questa specie e le conoscenze molecolari già acquisite in altre specie consentirà di identificare i meccanismi chiave dei processi di tolleranza e fornirà le conoscenze molecolari per sostenere il miglioramento di questi caratteri agronomici.
Al fine di fornire una visione complessiva della genomica della risposta a stress abiotico il presente Modulo verrà articolato in 3 azioni mirate alla descrizione del trascrittoma, della classe dei miRNA e delle modificazioni post-traduzionali del proteoma.

7B.1. Analisi del trascrittoma in risposta a stress idrico, salino e da freddo (CRA-GPG, DiProV-Unitus)
Questa attività verrà condotta sia in collaborazione con il Modulo 2, utilizzando la piattaforma trascrittomica Combimatrix sviluppata nel corso del progetto, sia tramite il ricorso a tecnologie di “next-generation sequencing” con le quali procedere al sequenziamento integrale di tutti i cDNA presenti nei campioni analizzati. Quest’ultimo approccio consentirà di evidenziare anche gli eventi di alternative splicing ed intron retention che possono interessare sino al 30% dei geni espressi in condizioni di stress (Mastrangelo et al., 2005; Mazzucotelli et al., 2008).
In generale l’olivo manifesta sintomi di sofferenza a temperature di 3-4°C e prolungati periodi al di sotto dello 0°C possono determinare il disseccamento degli apici e dei germogli. Pertanto, l’analisi della risposta trascrizionale all’abbassamento di temperatura verrà condotta utilizzando cultivar resistenti e cultivar sensibili al freddo esposte a temperature sub-letali, con e senza una fase di indurimento, per definire quali siano i meccanismi attivati in risposta all’abbassamento termico e la loro interazione con i meccanismi di vernalizzazione.
L’analisi trascrittomica della risposta allo stress idrico verrà condotta su genotipi contrastanti per caratteristiche fisiologiche associate alla tolleranza e sottoposti a diversi livelli di stress. I dati verranno analizzati tramite idonei software per identificare geni co-espressi ed i principali pathway metabolici attivati in risposta a stress. Gli stessi campioni saranno utilizzati per l’identificazione dei miRNA e l’analisi proteomica dedicata alla ricerca delle modificazioni post-traduzionali.

7B.2. Identificazione dei miRNA coinvolti nella risposta a stress abiotico (CRA-GPG)
Diversi lavori hanno dimostrato il coinvolgimento dei miRNA in processi fisiologici fondamentali, legati in particolare alle diverse fasi di sviluppo della pianta, quali il controllo della morfogenesi e della polarità nella foglia, la differenziazione e lo sviluppo fiorale, il processo di vascolarizzazione, la transizione tra fase vegetativa e riproduttiva (Zhang et al. 2006). Sono inoltre numerose le pubblicazioni riguardanti il ruolo dei microRNA nei processi di trasduzione legati all’azione di ormoni quali gibberelline ed auxine, oltre che nella risposta della pianta a stress biotici ed abiotici (Zhang et al., 2005; Phillips et al., 2007).
Nel presente progetto verranno studiati in particolare microRNA legati alla risposta della pianta a stress salino, da freddo e/o siccità. L’analisi del trascrittoma verrà rivolta sia all’identificazione dei microRNA presenti sia all’analisi di espressione dei putativi microRNA target. L’individuazione di polimorfismi entro le zone di legame microRNA-mRNA verrà utilizzata per evidenziare potenziali correlazioni tra tali polimorfismi e la risposta funzionale di diverse cultivar allo stress. Verranno inizialmente indagati microRNA conservati e noti per essere coinvolti nella risposta a stress in altre specie o potenzialmente legati a target già identificati come regolati da stress. A questa prima fase farà seguito un‘analisi del trascrittoma ottenuta mediante tecnologie di “next-generation sequencing”. Si prevede inoltre la messa a punto di un sistema high-throughput di analisi basato su qRT-PCR che consenta di caratterizzare dal punto di vista trascrizionale ed in risposta a stress singoli o multipli set di microRNA ed i corrispondenti target evidenziati come rilevanti nelle precedenti fasi di ricerca.

7B.3. Identificazione di meccanismi di controllo post-traduzionale nella risposta a stress abiotico (CRA-GPG)
Le modificazioni post-traduzionali rivestono un ruolo di fondamentale importanza nella definizione della struttura e della funzione delle proteine mature in quanto possono alterarne le proprietà chimico-fisiche, il folding, la conformazione, la stabilità, e di fatto modularne l’attività. Le principali modificazioni che le proteine possono subire sono la fosforilazione, che ne determina l’attivazione-disattivazione; la glicosilazione e la sumoylazione, che ne regolano l’emivita ed il targeting; l’acilazione per l’ancoraggio alle membrane; l’ubiquitinazione per la degradazione e per l’omeostasi proteica. Le modificazioni post-traduzionali rivestono un ruolo fondamentale nella regolazione della risposta a stress, determinando l’attivazione/repressione di fattori trascrizionali in grado di regolare l’intero processo molecolare alla base della tolleranza allo stress (Mazzucotelli et al., 2008).

Tra le diverse modificazioni post-traduzionali la fosforilazione ha un ruolo cardinale nel coordinare e regolare importanti aspetti del metabolismo, l’espressione genica, la crescita e la divisione cellulare. Il processo di fosforilazione-defosforilazione proteica è determinato dall’azione antagonistica di protein-kinasi e fosfatasi; circa un terzo delle proteine totali di una cellula eucariotica risultano soggette a fosforilazione e quasi il 4% del genoma di Arabidopsis codifica per delle protein-kinasi. (Kerk et al., 2002). La ricezione di uno stimolo sulla superficie cellulare porta spesso all’attivazione di kinasi e fosfatasi determinando una variazione del pattern di fosforilazione proteica cellulare. Il coinvolgimento delle kinasi nelle vie di trasduzione del segnale e nella risposta globale della pianta agli stress abiotici è stato sinora ampiamente dimostrato (Mazzucotelli et al., 2008; Frigerio et al., 2007; Peck et al., 2001; Thurston ety al., 2005; Renault et al., 2006).
Nell’ambito del progetto verrà analizzata la variazione dei pattern di fosforilazione proteica in giovani piante di olivo sottoposte a condizioni di stress salino e idrico di varia intensità. Gli estratti proteici saranno sottoposti ad arricchimento in fosfoproteine mediante cromatografia per affinità (MOAC: Metal Oxidative Affinity Chromatography) e successivamente sottoposti ad analisi bidimensionale (2D-PAGE). I pattern di fosforilazione saranno visualizzati mediante colorazione fluorescente selettiva. Gli spot differenziali identificati mediante l’analisi statistica dei profili bidimensionali ottenuti in diverse condizioni di stress idrico saranno eluiti dal gel ed analizzati mediante spettrometria di massa (LC-MS/MS). I dati ottenuti dall’analisi del fosfoproteoma saranno integrati a quelli derivanti dall’analisi trascrittomica al fine di fornire una visione sistemica della risposta della pianta ai diversi stress ambientali, evidenziando i punti di cross-regolazione e di interazione tra queste risposte.

I dati generati saranno opportunamente organizzati in una banca dati di geni espressi nell’ambito del Modulo 4 – Piattaforma bioinformatica.