Risorse genetiche e breeding

Coordinatori: Dr. Luciana Baldoni – CNR-IGV-PERUGIA, Dr. Giovanni Giuseppe Vendramin – CNR-IGV-FIRENZE

Obiettivi

L’attività ha come obiettivi principali:

  • il riordino e la caratterizzazione molecolare, fenotipica e sanitaria del germoplasma coltivato e spontaneo presente in Italia, secondo metodi validati a livello internazionale;
  • l’impiego delle popolazioni coltivate e spontanee per l’identificazione di marcatori associati a caratteri di adattamento;
  • la selezione clonale – sanitaria di varietà locali di olivo di particolare rilevanza per le più importanti realtà olivicole italiane;
  • la selezione di portinnesti clonali per il contenimento del vigore e l’induzione di resistenza a stress ambientali (idrico, salino, terreni anomali, ecc.) e biotici (Verticillosi);
  • la selezione di nuovi genotipi attraverso la definizione di un piano miglioramento genetico per incrocio, assistito da differenti strumenti molecolari e tecnologie innovative in grado di supportare e accelerare le tecniche convenzionali di breeding in olivo, al fine di ottenere portinnesti idonei e affini alle principali cultivar.

Attività previste

3.1. Caratterizzazione genetica e fenotipica del germoplasma coltivato e spontaneo

L’olivo annovera il germoplasma più ricco tra le specie coltivate, costituito da migliaia di varietà in coltivazione e da popolazioni di olivi selvatici (oleastri) presenti nell’area mediterranea e forme affini diffuse in Africa, Asia e Australia. L’intera variabilità genetica della specie si è conservata pressoché intatta fino ad oggi, grazie alla particolare longevità delle piante, all’adattamento alle diverse condizioni micro-ambientali e climatiche degli innumerevoli areali di coltivazione e alla mancata sostituzione delle varietà tradizionali con nuovi genotipi migliorati.
Tale germoplasma è una fonte di variabilità di fondamentale importanza per la conservazione e il miglioramento genetico della specie. Tuttavia, per l’utilizzazione di questa risorsa di variabilità è necessario disporre di informazioni sulla sua entità e distribuzione, sulle relazioni genetiche che intercorrono tra le diverse cultivar e tra queste e le piante selvatiche e sullo stato sanitario poiché elevato è il degrado della specie (15 specie virali fino ad oggi trovate su olivo).
Lo studio del germoplasma coltivato e selvatico e la sua caratterizzazione genetica, funzionale e sanitaria consentiranno l’individuazione dei genotipi portatori di importanti alleli utilizzabili nel miglioramento delle varietà coltivate.

Le attività previste sono:

3.1.1. Raccolta e catalogazione dei dati fenotipici di accessioni di germoplasma coltivato disponibile (CRA-OLI)
Verranno prese in considerazione le varietà dei principali paesi olivicoli, le cultivar italiane e le popolazioni di olivo selvatico provenienti da diversi siti del bacino del Mediterraneo. A tal fine ci si avvarrà della Collezione Nazionale delle Varietà di Olivo (CRA-OLI, Rende-Cosenza (616 genotipi di differente provenienza), della Collezione CNR (500 cultivar + 700 varietà minori) e delle collezioni regionali disponibili. Un numero elevato di tali genotipi è già stato caratterizzato, nel corso di più anni, da un punto di vista morfologico, agronomico e delle caratteristiche quali-quantitative del prodotto (resa in olio, composizione acidica, contenuto di polifenoli e di tocoferoli dell’olio).

3.1.2. Raccolta e catalogazione dei dati molecolari disponibili su germoplasma coltivato e spontaneo (CRA-OLI, CNR-IGV)
I dati molecolari precedentemente ottenuti attraverso l’analisi con marcatori SSR da diversi gruppi di lavoro saranno raccolti per costituire un database comune, per l’avvio della catalogazione del germoplasma olivicolo italiano. A tal fine potranno essere integrati i risultati ottenuti nell’ambito di diversi progetti quali: Progetto Interregionale OLVIVA, attualmente in corso e finalizzato alla caratterizzazione molecolare e fenotipica delle più importanti varietà di olivo italiane (200 cultivar), dal Progetto “Ricerca ed innovazione per l’Olivicoltura Meridionale”, RIOM, coordinato dal CRA-OLI di Rende e dalle attività pregresse del CRA-OLI e dal lavoro di caratterizzazione molecolare svolto presso il CRA-OLI mediante l’utilizzo di marcatori SSR, sulle accessioni della collezione sopra citata (Muzzalupo et al., 2006; Muzzalupo e Perri, 2008).
Per gli oleastri, oltre alla collezione realizzata presso il CNR-IGV di Palermo e che raccoglie esemplari di popolazioni di oleastri derivanti da siti con condizioni pedoclimatiche estreme (stress salino, siccità, terreni asfittici, ecc.), saranno utilizzati i dati fenotipici e molecolari derivanti da precedenti campagne di raccolta e analisi.

3.1.3. Genotyping del germoplasma coltivato e selvatico con marcatori sequence-based (CRA-OLI, CNR-IGVPG, UNITUS-DiProv)
I polimorfismi a livello di singolo nucleotide (SNP) sono le più comuni variazioni individuate nel genoma della maggior parte degli organismi e sono già state ampiamente utilizzate in studi di genomica strutturale e funzionale, nella valutazione della biodiversità e nella costruzione di mappe genetiche. Miglioramenti recenti nelle tecniche di individuazione e analisi degli SNP hanno consentito lo sviluppo di analisi high-throughput e la scansione di ampie regioni del genoma.

  • Per il genotyping si procederà con l’impiego dei marcatori SNP (almeno 1500) su geni candidati e sequenze EST e nuovi marcatori SSR (~500) tri-, tetra- e penta-nucleotidici su sequenze genomiche e da trascritti identificati nell’ambito delle attività previste in 1.1.4 e nei moduli di genomica strutturale e funzionale e nei diversi distretti.

I nuovi marcatori SNP e SSR saranno utilizzati per la caratterizzazione delle varietà coltivate e degli olivi selvatici.
Geni connessi con la regolazione dello sviluppo, dell’adattamento alle condizioni ambientali, della sintesi dei metaboliti secondari saranno analizzati con la tecnologia HRM per l’individuazione di polimorfismi allelici, da impiegare in seguito nella genotipizzazione degli altri 1800 genotipi presenti nelle collezioni. La genotipizzazione con l’uso di SNP potrà essere eseguita attraverso tecniche microarraying. In alternativa potranno essere applicate tecniche di analisi HRM (High Resolution Melting) (Muleo et al., 2009).
Si prevede inoltre di identificare SNP a carico del mtDNA da affiancare ai marcatori nucleari per chiarire le relazioni genetiche intercorrenti tra le cultivar e le piante selvatiche. A causa dell’elevato grado di eteroplasmia riscontrata in olivo per il genoma mitocondriale, effetto della propagazione vegetativa cui per millenni sono state soggette le varietà coltivate (Garcìa-Dìaz et al., 2003), gli SNP saranno ricercati soprattutto su sequenze geniche codificanti del mtDNA.

3.1.4. Raccolta, caratterizzazione e catalogazione delle varietà di olivo locali

Verrà realizzato un network di iniziative volte all’identificazione delle varietà locali e alla valutazione del loro sato sanitario, del loro comportamento agronomico, dei caratteri di qualità dell’olio e di adattamento e resistenza agli stress, costituendo un database nazionale comune.
Verranno prese in considerazione le varietà raccolte nelle collezioni regionali, con particolare riferimento alle varietà minori, agli ecotipi locali e agli olivi antichi.
La verifica dello stato sanitario verrà effettuata con protocolli di diagnosi molecolare validati a livello nazionale.
Il genotyping di queste varietà verrà effettuato in maniera coordinata centralmente e con l’impiego di marcatori SSR precedentemente validati e su marcatori funzionali quali gli SNP, disegnati su geni candidati per resistenza, accumulo di olio, metabolismo dei polifenoli, portamento dell’albero, ecc.
Attraverso analisi di parentage e genealogia delle varietà di maggiore interesse sarà possibile stabilirne l’eventuale origine autoctona, valutando il loro legame con il territorio di coltivazione e il grado di adattamento.
Lo studio si propone di chiarire anche l’evoluzione di importanti varietà di olivo italiane, con particolare riferimento all’analisi delle relazioni genetiche delle varietà moderne con paleo-varietà e forme selvatiche.
Attraverso una mappatura complessiva delle risorse genetiche locali si raccoglieranno le informazioni in grado di indirizzare le politiche di salvaguardia e valorizzazione dei genotipi di maggiore interesse.

3.1.5. Sviluppo di marcatori molecolari per la rintracciabilità molecolare (DNA tracking) della composizione varietale dei prodotti olio e olive da tavola (CNR-IGV-PG)
L’impiego di marcatori molecolari basati sull’analisi delle tracce di DNA presenti negli oli di oliva in commercio rappresenta un’alternativa potenzialmente molto efficace alle analisi chimiche e un complemento alla tracciabilità di filiera, fornendo nuovi strumenti per la lotta alle sofisticazioni e per la salvaguardia degli oli di origine italiana.
I metodi di rintracciabilità molecolare sono in grado di risalire alle varietà da cui gli oli di oliva commercializzati sono stati estratti e/o smascherare eventuali frodi, quali l’aggiunta di oli di altre specie vegetali, quali nocciolo, mais, girasole o soia.
Tenuto conto di quanto già acquisito, si intende procedere con le seguenti attività:

  • identificare marker in grado di discriminare in modo univoco le varietà di olivo italiane e quelle più importanti dei paesi da cui si importa;
  • stabilire le percentuali di composizione delle miscele tra più varietà e la soglia minima di sensibilità del metodo;

Identificazione marker in grado di discriminare in modo univoco le varietà di olivo italiane e quelle più importanti dei paesi da cui si importa. L’impiego di marcatori molecolari basati sul DNA plastidiale, rispetto ai marcatori nucleari, presenta alcuni vantaggi, quali l’elevato numero di cloroplasti e quindi di molecole di DNA plastidiale per cellula, con conseguente aumento della probabilità di rinvenire tracce di DNA nell’olio, l’origine materna dei cloroplasti e quindi l’eliminazione del rischio di amplificazione di DNA proveniente da impollinatori, il genoma apolide, con un solo allele per genotipo, ed infine il basso polimorfismo, che aumenta la probabilità di reperire marcatori specie- e cultivar-specifici.
Per l’identificazione delle regioni polimorfiche è stato sequenziato tutto il genoma plastidiale e sono state identificate diverse regioni potenzialmente polimorfiche (Baldoni, unpublished data).
L’attività programmata in questa fase prevede l’identificazione del maggior numero di marcatori plastidiali in grado di discriminare le varietà di maggiore interesse per l’olivicoltura italiana e per identificare eventuali oli da varietà di altri paesi (es. Spagna e Tunisia).
Ai marcatori plastidiali verranno affiancati anche marcatori Single Nucleotide Polymorphism (SNP) su geni nucleari in numero sufficiente (almeno 3 per cultivar) a discriminare in maniera certa le cultivar target.
Definizione delle percentuali di composizione delle miscele tra più varietà e della soglia minima di sensibilità del metodo. Una volta identificati i marcatori in grado di discriminare una cultivar dall’altra essi verranno applicati al DNA estratto da olio che, in generale, risulta altamente degradato e complessato con altre molecole (polisaccaridi, proteine, ecc.) che lo rendono difficilmente amplificabile. Inoltre, nella maggioranza dei casi, gli oli di oliva sono costituiti da miscele tra oli derivanti da varietà diverse, in proporzioni ignote a priori.
Per questa ragione verranno amplificati frammenti corti o cortissimi (al massimo 120 bp).
Su miscele di oli con percentuali variabili di due (50-50; 75-25; 90-10; 95-5) o più varietà verranno utilizzati approcci di Quantitative PCR in grado di rilevare la presenza di varietà fino ad una percentuale minima del 5%.

In questo ambito verranno sviluppati marcatori specifici per la certificazione molecolare degli oli di oliva extra vergini di interesse regionale.

 

3.1.6. Association mapping: associazione tra marcatori e fenotipo basata sul linkage disequilibrium (CNR-IGV-FI)

Le strategie classiche per l’identificazione di geni che controllano caratteri quantitativi non sono molto efficaci nelle specie arboree a causa del lungo tempo di generazione, la difficoltà di ottenere popolazioni segreganti e soprattutto per le grandi dimensioni dei genomi, che rendono impraticabili approcci di scansione del genoma alla ricerca di regioni coinvolte nel carattere in esame.
Una nuova strategia, la mappatura per associazione (Association Mapping, AM), consiste invece nel percorso inverso: da individui di una popolazione naturale si stima il Linkage Disequilibrium (LD) tra SNP su geni candidati e il carattere in esame, previa stima del tasso di decadimento dell’LD con la distanza fisica dal gene corrispondente (Flint-Garcia et al., 2003; Rafalski e Morgante, 2004).
Lo scopo principale di questa attività è quello di porre le basi per l’AM di caratteri adattativi in olivo. Attraverso l’approccio di Association Mapping, infatti, è possibile mappare quei geni con deboli effetti fenotipici ma particolarmente importanti per i processi adattativi (Akey et al., 2002; Luikart et al., 2003; Schloetterer, 2003). Per l’olivo, quale specie poliennale, prevalentemente allogama e per la quale si dispone di numerose varietà e popolazioni selvatiche, quest’approccio rappresenta un’alternativa importante e molto promettente per la mappatura fine di loci di particolare interesse agronomico.
La ricerca sarà condotta su quei geni coinvolti nella resistenza agli stress idrico e salino, nella fenologia della gemma e nella resistenza a patogeni.
Marcatori microsatelliti verranno utilizzati per stimare la differenziazione tra popolazioni e, più in generale, per monitorare i processi demografici. (CNR-IGV-FI)
A livello dei geni candidati si cercheranno tracce di selezione utilizzando test classici di neutralità, che assumono come ipotesi nulla l’assenza di selezione, quali il D di Tajima, che sarà stimato per locus sia sulla base dell’intera sequenza sia utilizzando un approccio sliding windows, e il test di Fu (Fu, 1997). Entrambi i test possono essere influenzati dai processi demografici, per cui si prevede di realizzare anche: i) Fay and Wu’s H-test (Fay and Wu 2000), (ii) Hudson-Kreitman-Aguade´ (HKA) test (Hudson et al. 1987), e (iii) McDonald-Kreitman (MK) test (McDonald and Kreitman 1991). La selezione locale può determinare picchi di differenziazione tra popolazioni a livello o in prossimità del locus sottoposto a selezione (Charlesworth et al. 1997). Per identificare la regione che ha valori di differenziazione significativamente più alti saranno eseguite delle simulazioni basate su un infinite-island model.

Analisi dell’estensione del LD entro e tra geni diversi e tra popolazioni diverse.
Le statistiche descrittive dell’LD (r2, Hill and Robertson 1968) saranno calcolate utilizzando il software Tassel. La scelta di r2 è determinata dal fatto che questo parametro è meno sensibile alle dimensioni del campione rispetto, ad esempio, a D’ (Flint-Garcia et al. 2003). Il decadimento del LD con la distanza fisica sarà definito interpretando i dati con funzioni ad hoc. Anche queste stime saranno ottenute ai diversi livelli gerarchici (entro popolazione, tra popolazioni, entro gene, tra geni).
L’analisi della distribuzione geografica della specie consentirà di individuare popolazioni naturali (o varietà) adattate ad ambienti differenti per uno o più variabili pedo-climatiche. Tali popolazioni, dopo essere state analizzate tramite marcatori molecolari indipendenti per l’eventuale presenza di stratificazioni genetiche, potranno essere “genotipizzate” con vari tipi di marcatori molecolari. Per ogni locus analizzato, sarà calcolato l’Fst di Wright e i marcatori con Fst superiore ad un valore soglia saranno investigati come marcatori associati a regioni oggetto di selezione durante il processo di domesticazione e/o breeding (adaptative candidate genes). Una simile strategia è stata applicata con successo in mais (Vigouroux et al., 2002) consentendo di individuare una serie di microsatelliti situati in loci che controllano l’architettura della pianta. Analoghi studi, condotti con marcatori SNP in popolazioni umane, hanno permesso di individuare una serie di loci coinvolti nelle risposte a vari tipi di patologie genetiche.
Nelle specie arboree, gli studi di associazione basati su un approccio di geni candidati dovrebbero essere favoriti. Un approccio basato su un genome wide-scan è poco praticabile a causa dell’elevato numero di SNP necessario e per il rapido decadimento del LD (Neale and Savolainen, 2004). I risultati raccolti nell’ambito di questa proposta potrebbero quindi essere di primaria importanza per definire le più appropriate strategie di Association Mapping di geni candidati. Geni o porzioni di essi che manifestano deviazioni dalla neutralità rappresenteranno i target per gli obiettivi sopra citati. La presenza di strutturazione genetica e di variazioni nel decadimento del LD tra popolazioni rappresenta un’informazione di primaria importanza per realizzare un corretto campionamento in studi di associazione. D’altro canto, la ricerca di regioni che manifestano significativa divergenza (a possibile valenza adattativa) in geni candidati può permettere di identificare variazioni clinali e pattern indicativi di adattamento a condizioni locali.

 

3.2. Breeding e selezione delle varietà locali

Gli obiettivi principali del breeding convenzionale riguardano costanza e precocità di entrata in fruttificazione, incremento del numero e dimensioni dei frutti, aumento del contenuto in olio e miglioramento della sua qualità (composizione in acidi grassi, contenuto in polifenoli, tocoferoli e composti di interesse nutraceutico, attributi sensoriali), aumento della resistenza agli stress biotici, al sale, alla siccità ed al freddo, riduzione della taglia degli alberi e modificazione dell’architettura della chioma per facilitare la raccolta meccanizzata.
Si intende agire su quattro aspetti fondamentali:

  • Aumento della produttività per unità di superficie;
  • Induzione di resistenza ai patogeni e parassiti più pericolosi (mosca, verticillosi, occhio di pavone) e agli stress ambientali (freddo, siccità, salinità);
  • Adattamento delle piante alla meccanizzazione delle operazioni di raccolta e potatura;
  • Miglioramento delle caratteristiche qualitative dell’olio e delle olive da tavola.
  • Rilascio di nuovi genotipi e portinnesti clonali con requisiti genetico-sanitari conformi alle normative vigenti.

Le attività previste sono:
3.2.1. Valutazione fenotipica delle progenie da incrocio disponibili (CNR-IGV, CRA-OLI).
Il CNR-IGV-PG dispone di progenie derivanti da incroci intervarietali e interspecifici per un totale di diverse migliaia di semenzali di diversa età (da 2 a 10 anni). Queste piante verranno propagate e messe in coltura in diversi campi sperimentali per le osservazioni del fenotipo con particolare riferimento ai caratteri di interesse per la selezione.
Anche altri partner del progetto dispongono di materiale in avanzata fase di selezione.
Tali progenie potranno essere sottoposte a valutazione per i caratteri: dimensione del frutto, resa in olio, autofertilità, resistenza alla mosca e alla verticillosi, resistenza a siccità, salinità, terreni anomali, resistenza ai patogeni, architettura dell’albero, ecc.).
Sono disponibili campi sperimentali in punti strategici per la valutazione della progenie (Sicilia, Basilicata, Calabria, Umbria), nei quali sarà possibile stimare l’interazione del genotipo con l’ambiente e individuare in modo preciso la quota di varianza genetica additiva responsabile dell’espressione di caratteri quantitativi agronomicamente importanti e per caratteri di adattamento.
Le progenie in selezione, oltre alla valutazione dei principali caratteri del fenotipo, saranno sottoposte alle seguenti analisi:

  • “fingerprint” metabolico ottenuto dalla combinazione di spettri FT-IR, FT-NIR/NIRA o Py-MS;
  • caratterizzazione dei nuovi genotipi mediante analisi chimica e ultrastrutturale delle cere epicuticolari ed eventuale selezione in funzione della tolleranza a stress biotici e abiotici;
  • localizzazione istochimica degli enzimi coinvolti nei principali processi metabolici;
  • studio a livello ultrastrutturale delle caratteristiche cinestetiche (durezza, fibrosità e croccantezza);
  • valutazione dell’attitudine varietale dei nuovi genotipi alla trasformazione come frutti da mensa.

3.2.2. Selezione assistita dai marcatori molecolari (MAS) (CNR-IGVPG)
QTL eventualmente identificati nell’ambito delle attività di mappatura genetica potranno essere direttamente applicati alle progenie in selezione.

3.2.3. Rilascio di nuovi genotipi. (CNR-IGVPG)
Per i nuovi genotipi in fase più avanzata di pre-selezione potranno essere avviate le pratiche di moltiplicazione e valutazione finale.
Per la selezione di nuove varietà destinate agli ambienti più difficili, ai limiti di sopravvivenza per la specie (aree fredde, saline, terreni anomali, ecc.) le varietà locali minori, con particolare riferimento agli esemplari plurisecolari e ultramillenari, che manifestano evidenti capacità di adattamento alle condizioni locali avendo superato una lunga fase di pressione selettiva potranno rappresentare una fonte di variabilità utilissima.

Infine, per migliorare le performance produttive delle varietà tradizionali, si ricorrerà alla selezione di portinnesti in grado di modificare il comportamento agronomico delle varietà innestate. Per la selezione dei portinnesti la facilità di propagazione rappresenta un pre-requisito fondamentale.

 

3.2.4. Selezione di portinnesti clonali per migliorare le caratteristiche colturali delle varietà locali

La sostenibilità economica della coltivazione di varietà locali di grande interesse qualitativo è condizionata dai limiti agronomici di questi genotipi, quali, in generale, l’elevato vigore degli alberi e la suscettibilità agli stress.
Per queste ragioni si rende necessaria la selezione di portinnesti clonali in grado di regolare lo sviluppo della pianta e indurre resistenza a condizioni ambientali avverse (salinità, siccità, terreni anomali, ecc.) e ai patogeni (Verticillium dahliae).
Le ricerche nell’ambito dei portinnesti di olivo, a differenza di altre colture frutticole, è stata scarsa e poco si conosce del contributo dei portinnesti per il controllo dell’epibionte.
Si prevede la valutazione di ecotipi locali e di popolazioni di olivi selvatici raccolti da siti caratterizzati da condizioni ambientali estreme (terreni salsi, superficiali, pietrosi, aridi, argillosi, ecc.).
Da un primo gruppo di genotipi tolleranti a condizioni di salinità, aridità o asfissia radicale, e quelli resistenti al Verticillium, già in avanzato stato di valutazione, verranno selezionati e propagati i più interessanti e verranno testati in combinazioni di innesto con diverse varietà e in diverse condizioni colturali.
Per la selezione di portinnesti nanizzanti si procederà con la valutazione del comportamento, in diverse combinazioni di innesto, di varietà, oleastri e specie affini potenzialmente in grado di indurre portamento compatto dell’albero.
La selezione di portinnesti clonali tolleranti a stress e/o in grado di modificare il portamento degli epibionti consentirà di adattare le varietà locali alle tecniche di coltivazione a basso input di manodopera e/o di estendere la coltura su terreni particolarmente difficili.

3.2.5. Selezione sanitaria
La selezione clonale di varietà locali e portainnesti sarà affiancata dalla selezione sanitaria al fine di verificare lo stato sanitario delle varietà locali e dei portainnesti individuati e selezionare i cloni che siano conformi ai requisiti genetico-sanitari riportati dalla normativa vigente per la produzione di materiale di olivo “certificato” (D.M. 20/11/2006). I controlli verranno effettuati con protocolli di diagnosi molecolare validati a livello nazionale.

 

3.2.6. Induzione di genotipi sintetici (doppi aploidi) (UNITUS)
Si intende procedere alla produzione di aploidi o doppio-aploidi (DH) per ottenere linee omozigoti da utilizzare per il sequenziamento del genoma al fine di evitare l’impiego di varietà altamente eterozigoti che impediscono o complicano l’assemblaggio delle sequenze prodotte.
Il ricorso ai metodi convenzionali di riduzione dell’eterozigosi attraverso autofecondazione per successive generazioni, come realizzato per esempio in vite (The French-Italian Public Consortium for Grapevine Genome Characterization, 2007), è ritenuto impraticabile per l’olivo in considerazione dei lunghi tempi di generazione della specie e della mancanza di popolazioni inbred.
Per l’ottenimento degli aploidi si impiegherà l’embriogenesi gametica, rigenerando embrioni dal gamete maschile.
L’androgenesi, per mezzo della coltura in vitro di antere o microspore isolate, è il metodo più efficiente e largamente utilizzato per produrre aploidi e doppio-aploidi ed è stato impiegato in diverse piante arboree, come agrumi, melo e pesco (Germanà, 2006). In particolare, la coltura di microspore isolate è stata condotta in due cultivar spagnole ed è stato possibile osservare divisioni sporofitiche, microspore multi-nucleate ed anche strutture multicellulari (Solìs et al., 2008). Strutture multicellulari derivanti dal polline sono state ottenute anche in due cultivar italiane di olivo, Nocellara Messinese e Tonda Iblea (Germanà, dati non pubbl.).
I processi a cui si è fatto riferimento sono altamente dipendenti dal genotipo e molte indagini devono essere condotte per migliorarne la conoscenza e la comprensione.

  • Verranno caratterizzati i diversi stadi del processo per mettere a punto protocolli efficienti da utilizzare per la produzione di piante aploidi o doppio-aploidi;
  • Verranno determinate le sequenze temporali degli eventi e degli stadi di sviluppo durante i primi stadi dell’embriogenesi;
  • Verranno determinati i marcatori cellulari e molecolari per l’induzione embriogenetica in paragone con lo sviluppo del gametofito, per identificare i cambiamenti metabolici associati con la variazione del programma di sviluppo;
  • Verranno osservati i cambiamenti nei comparti citoplasmatici e nucleari (amido, vacuoli, condensazione della cromatina, corpi nucleari) e nella struttura e composizione delle pareti cellulari (presenza di cutina e callosio, cambiamenti nelle pectine e livello di esterificazione).

I presunti aploidi ottenuti andranno successivamente caratterizzati mediante citometria a flusso, conta cromosomica e analisi con marcatori SSR (Yahata et al., 2009).
Gli aploidi ed i doppio-aploidi eventualmente prodotti potranno essere impiegati anche per altre finalità, costituendo un interessante potenziale per la mutagenesi, la selezione, l’analisi genetica, la trasformazione e per l’utilizzo della variabilità gametoclonale ai fini dell’ottenimento di nuove cultivar.